人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKαL2表达载体的构建和鉴定
【出 处】:
【作 者】:
卢俊
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徐世元
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崔睿
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张庆国
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雷洪伊
【摘 要】目的构建表达人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pEGFP-N1-AMPKα2载体,转染SH-SYSY细胞系,观测其上调AMPKα2基因的效果。方法PCR法扩增AMPKα2基因片段,克隆到pEGFP-N1质粒载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用质脂体将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染到SH-SYSY细胞系,经G418筛选阳性克隆后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达。流式细胞仪检测转染重组质粒细胞内ROS变化。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,pEGFP-N1-AMPKα2表达载体构建成功。重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染SH-SY5Y细胞系后,细胞中AMPKα2蛋白表达量明显增高。SH-SY5Y细胞转染pEGFP-N1-AMPKα2后,ROS含量增多。结论成功构建了人AMPKa2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表达载体。pEGFP-N1-AMPKα2能有效上调AMPKa2基因在SH-SY5Y细胞系中的表达,为将来应用其研究AMPK在局麻药致细胞损伤中的作用奠定了基础。
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